如果能夠建立識別單個蛋白質中單氨基酸分辨率的工具對于細胞生物學的研究將有巨大的推動作用。但目前能做得到的是對基因序列進行測序，但是無論是DNA基因組還是RNA轉錄組都不能帶給我們對于蛋白質的全面認識，因為蛋白質中還包含翻譯后修飾以及剪接相關的信息。因此，在單分子水平上能夠直接將蛋白質測序并檢測翻譯后修飾的穩健方法將極大地有利于蛋白質組學的研究，促進對于低豐度蛋白以及翻譯后修飾分布的檢測。為此，荷蘭代爾夫特理工大學研究組在發文題為，Multiple rereads of single proteins at single-amino acid resolution using nanopores，提供了一種基于納米空測序的單分子蛋白閱讀器，可以以高保真度和高通量區分單個蛋白質在單一氨基酸分辨率下的信息。
納米孔測序是一種單分子DNA測序技術，該技術能夠在便攜式平臺上以最小的成本長時間讀取和檢測表觀遺傳標記，最早起源于上世界80年代的幾個實驗室。在納米孔測序中，納米孔作為生物傳感器提供了唯一的通道，使兩種不同的離子溶液被電壓為基礎的膜給隔開，形成順式一側和反式一側。分子通過納米孔的時候在順反兩側產生離子電流，通過聚合酶或者解旋酶與多核苷酸緊密結合，逐步控制核苷酸通過納米孔，不同堿基產生不同的電流，從而讀出核苷酸序列。因此，納米孔最窄的孔徑區域就是其傳感區域，通過納米孔和沿著核苷酸行走的解旋酶，促使DNA以一個一個堿基的方式通過納米孔。
圖1 納米孔技術
有人曾經提出假設，可以利用納米孔技術對蛋白質也進行單個氨基酸的測序，研究表明小肽片段通過納米孔自由轉運的方式可以對單個氨基酸表現出敏感性，但是目前尚缺乏地確定氨基酸順序以及重建蛋白質序列的方法。為此，作者們。該鏈由一條80個核苷酸的DNA鏈組成，通過疊氮化合物修飾共價鏈接一個26氨基酸的合成肽，該肽段中富含帶負電的氨基酸比如天冬氨酸和谷氨酸，這樣通過電滲力將多肽拉過納米孔。納米孔使用的突變型的MspA，具有杯子的形狀，可以將解旋酶從離子電流阻塞的孔收縮過程中分離出約10 nm。對于DNA易位動力蛋白酶，作者們使用的是Hel308 DNA解旋酶。使用該解旋酶是因為通過MspA拉動DNA單鏈每次的長度是0.33nm，剛好是單個氨基酸的步長，另外該解旋酶比較穩定且能夠耐受高鹽，而且其拉力大于50pN可以解開任何的靶標多肽的二級結構。
圖2 通過納米孔閱讀單肽
作者們發現，類似于DNA序列的納米孔讀取，通過納米孔的多肽會在離子流中產生一個獨特的階梯狀模式。每次讀取時離子電流步驟的持續時間各不相同，但水平序列信號特征具有高度的可重復性。通過建立識別軟件，作者們可以準確識別電流信號，并對電流中值進行分析，從而回溯確認序列的信息。
圖3 DNA-肽結合體通過納米孔以及電流讀數
進一步地，作者們想對該系統的精確性進行分析，因此作者們構建了不同的DNA-肽結合體，但是每個結合體中只改變某一個氨基酸，從而可以確認在單氨基酸改變的情況下該系統是否能夠識別出不同。作者們發現電流信號在多個水平上具有差異，表明即使是單一氨基酸的替換也可以被該系統區分出來。為了定量評估對于多肽變異的可區分性，作者們進行了混淆矩陣的計算，發現可以以87%的平均準確率識別氨基酸變體。作者們發現通過連續控制解旋酶對同一分子進行多次獨立的重新讀取，可以消除導致納米孔讀取不準確的隨機錯誤，從而大幅度提高納米孔蛋白讀取器的識別保真度。
但作者們對該方法的局限性也進行了分析，發現納米孔可以能夠順利轉運帶有中性極性、非極性以及正電極性的氨基酸多肽，但是高正電荷的多肽易位轉運的效率很有限。但幸運的是，通過對人類蛋白質組的分析顯示，帶負電荷的蛋白質序列比帶正電荷的蛋白質序列更常見。
總的來說，該工作建立了能夠以單氨基酸精度進行多肽測序的方法，不需要對設備進行重新的設計只需要改變樣品制備和對電流信號進行數據分析的軟件即可達到目標。該工具仍然保留了納米孔進行DNA測序的特點，低成本、且對單個分子的微小物理變化非常敏感。該工作向著低成本蛋白質測序的邁出了新的一步，能夠實現單細胞蛋白質組學研究，為基礎生物學和臨床中的應用提供了新的思路。
原文鏈接：
https://www.science.org/doi/10.1126/science.abl4381
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